近日，中國科學院南海海洋研究所張長生研究員團隊和廈門大學王斌舉教授團隊合作在氮雜蒽醌類海洋多環(huán)天然產物Deoxynybomycin（DNM）和Nybomycin（NM）生物合成與酶反應機制研究方面取得新進展，相關成果 “Deciphering Deoxynybomycin Biosynthesis Reveals Fe(II)/ -Ketoglutarate Dependent DioxygenaseCatalyzed Oxazoline Ring Formation and Decomposition”在線發(fā)表于Journal of the American Chemical Society (《美國化學會志》)。博士后劉凱，博士張光濤、張錦巖（廈門大學）為共同第一作者，張長生、王斌舉與張光濤為共同通訊作者。
惡唑啉是天然藥物中的重要活性基團，在有機合成小分子活性化物結構衍生和修飾中有著廣泛應用。2-惡唑啉環(huán)是自然界中常見的結構形式，其在非核糖體肽、核糖體肽和苯并惡唑類天然產物中的生物合成途徑已經闡明?？股谼NM和NM是自然界中罕見的含有4-惡唑啉基團的氮雜蒽醌類化合物。DNM具有顯著抗革蘭氏陽性菌活性，也是開發(fā)抗革蘭氏陰性菌的藥物先導化合物，其作用機制是與DNA 型拓撲異構酶靶向結合，阻礙細菌DNA合成而發(fā)揮抗菌作用。DNM中的4-惡唑啉環(huán)是關鍵藥效團，但其生物合成機制一直是未解之謎，限制了對這類活性氮雜蒽醌天然產物的深度挖掘和開發(fā)利用。
研究團隊早期從南海深海沉積物來源的假諾卡氏菌（Pseudonocardia antitumoralis SCSIO 01299，張偲院士和田新朋研究員提供）分離發(fā)現(xiàn)了氮雜蒽醌類多環(huán)天然產物脫氧苯醌（Deoxynyboquinone，DNQ）（Mar Drugs, 2011,9:1428-1439）。近期，與澳門大學副教授余華合作揭示了DNQ的抗炎活性靶點與作用機理，發(fā)現(xiàn)DNQ可靶向烷基化修飾信號通路(Keap1-Nrf2-ARE)中Keap1上的關鍵位點Cys489，促使Keap1泛素化，并釋放Nrf2進入細胞核激活下游抗炎效應因子的表達，從而發(fā)揮顯著的抗炎活性（J. Pharm. Anal. 2023, doi:10.1016/j.jpha.2023.07.009）。
DNM與DNQ擁有相似的三環(huán)氮雜蒽醌線性骨架結構，可能具有相同的生源途徑。本研究基于生物信息學分析定位了菌株SCSIO 01299和Embleya hyaline NBRC 13850（DNM產生菌）基因組中DNQ（dnq）和DNM（dnm）的生物合成基因簇（圖1），進一步通過體內遺傳與體外生化實驗，發(fā)現(xiàn)了二者生物合成途徑中的共同中間體5（圖2），闡明了甲基轉移酶DnmS負責DNQ和DNM氮甲基化后修飾，兩個同源的Fe(II)/ -KG依賴型雙加氧酶DnmT和DnmU分別負責DNM中4-惡唑啉環(huán)的形成和C-12位的羥基化（圖2）。
圖1. 氮雜蒽醌類天然產物與其生物合成基因簇
在進行體外酶反應研究時，研究團隊意外發(fā)現(xiàn)DnmT既能催化惡唑啉環(huán)的形成產生DNM，也能催化DNM中惡唑啉環(huán)的開環(huán)和脫N-甲基，最終形成中間體5，從而逆轉DNM的生物合成。為闡釋DnmT催化惡唑啉成環(huán)與開環(huán)的酶學基礎，研究團隊基于酶蛋白建模、點突變以及分子動力學（MD）模擬和量子力學/分子力學（QM/MM）多尺度計算化學等方法詳細解析了DnmT催化成環(huán)、開環(huán)和脫甲基反應的新穎酶學機制，同時通過體外實驗捕捉到反應中間體14，進一步佐證了該反應機理的合理性（圖2）。
圖2. Fe(II)/ -KG依賴型雙加氧酶DnmT催化惡唑啉成環(huán)、開環(huán)和脫甲基化反應的機制
此外，研究團隊還初步探索了DnmT催化多種反應的生物學意義。進一步發(fā)現(xiàn)，在野生菌株中，絕大部分DNM被分泌至胞外，而胞內含量較少；活性評估顯示，DNM對革蘭氏陽性菌的抑菌活性顯著強于NM及其它中間體和副產物。由此，研究團隊推測，DnmT催化惡唑啉成環(huán)產生DNM并釋放到環(huán)境中，殺死自己的競爭者，提升自身的生存能力；而催化惡唑啉開環(huán)和脫甲基可能是為了控制胞內DNM的濃度，減少對細菌自身的毒性，這一假設有待進一步的深入研究證實。
綜上所述，本研究解析了抗生素DNM中罕見4-惡唑啉藥效團的合成途徑，并利用酶學和計算化學等方法揭示了新穎多功能Fe(II)/ -KG依賴型雙加氧酶DnmT催化惡唑啉成環(huán)、開環(huán)和脫甲基化的酶學機制，為Fe(II)/ -KG依賴型雙加氧酶在天然產物生物合成中的功能多樣性以及其可能的生物學意義提供了新見解，同時也為活性氮雜蒽醌類天然產物的基因組挖掘提供了重要科學依據(jù)。
上述研究工作得到了國家自然科學基金、廣東省海洋經濟發(fā)展（海洋六大產業(yè)）專項資金、海南省重大科技計劃和中國科學院王寬誠率先人才計劃“盧嘉錫國際團隊項目”等的資助。
相關論文信息：1、Kai Liu#, Jinyan Zhang#, Guangtao Zhang#,*, Liping Zhang, Zhen Meng, Liang Ma, Wenjun Zhang, Weiliang Xiong, Yiguang Zhu, Binju Wang*, Changsheng Zhang*. Deciphering deoxynybomycin biosynthesis reveals Fe(II)/ -ketoglutarate-dependent dioxygenase-catalyzed oxazoline ring formation and decomposition. J. Am. Chem. Soc. 2023. https://doi.org/10.1021/jacs.3c11772
2、Ke-Gang Linghu, Tian Zhang, Guangtao Zhang, Peng Lv, Wenjun Zhang, Guanding Zhao, Shihang Xiong, Qiushuo Ma, Mingming Zhao, Meiwan Chen, Yuanjia Hu, Changsheng Zhang*, Hua Yu*. Small molecule deoxynyboquinone triggers alkylation and ubiquitination of Keap1 at Cys489 on Kelch domain for Nrf2 activation and inflammatory therapy. J. Pharm. Anal. 2023. doi: 10.1016/j.jpha.2023.07.009
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